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全做平时实验protocol记录
Western Blot（WB）实验原理
Western Blot（WB）实验是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术，其原理如下：
- 样品制备：
- 提取蛋白质并定量，以确保每个样品的蛋白质量一致。
- 蛋白质电泳：
- 使用SDS-PAGE将样品中的蛋白质分离。SDS赋予蛋白质负电荷，并根据分子量大小进行分离。
- 转膜：
- 将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
- 封闭：
- 使用封闭液（如含5%牛奶或BSA的缓冲液）封闭膜上的非特异性结合位点。
- 抗体孵育：
- 孵育一抗（针对目标蛋白的特异性抗体）。
- 孵育二抗（针对一抗的抗体，通常标记有酶或荧光染料）。
- 信号检测：
- 使用化学发光底物（如ECL）或荧光成像系统检测二抗标记的信号。
- 结果分析：
- 通过图像分析软件定量蛋白质条带的光密度，比较不同样品间目标蛋白的表达量。
Western Blot实验通过上述步骤实现对特定蛋白质的检测和定量分析，具有特异性高、灵敏度强的优点。
🤔 蛋白提取
- 配制蛋白裂解液（RIPA：PI：PMSF = 1000:10:1）。【部分情况下RIPA：PI：PMSF = 100:10:1】
- 根据细胞量加裂解液（小皿 150ul；六孔板的一孔 150ul），冰上裂解20min
- 超声（on 5s；off 10s；湿度 35%）✖️5次循环
- 4摄氏度遇冷离心机 12000rpm 15min，取上清至空EP管中
- 配制BCA工作液（A液：B液=49:1）
- 64孔板依次加入 18ul PBS，2ul 蛋白样本，200ul 配置后BCA工作液，37摄氏度孵育30min，酶标仪测试吸光度
- 最后根据公式计算蛋白浓度，配制蛋白溶液，用于WB实验。
📝 WB实验
- 配制电泳液（5X电泳:ddH20 = 1:4），一般4块板需要1瓶
- 电泳（80V恒压至下层胶后改为120V）
- 转膜前物品准备：膜（4.5*8.5cm），无水乙醇激活
- 转膜（400mA 30min-35min +1块冰）
- 封闭（快封使用PBS稀释，封闭35min；5%脱脂奶粉封闭2-3h）
- 一抗孵育1.5h
- TBST 10min✖️3次
- 二抗孵育1.5h
- TBST 10min✖️3次
🤪 显影
- 配制显影液（1:1）
- 显影
🥹 Western Blot（WB）实验的应用
Western Blot（WB）实验在分子生物学、生物化学和细胞生物学等领域有广泛的应用，具体包括：
- 蛋白质表达分析：
- 检测和比较不同细胞或组织样品中目标蛋白质的表达水平。
- 研究基因在转录后的表达产物。
- 蛋白质修饰研究：
- 检测蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基化等。
- 研究蛋白质修饰在细胞信号传导中的作用。
- 信号通路研究：
- 分析细胞信号传导途径中关键蛋白质的表达和修饰状态。
- 研究信号通路在正常生理和病理状态下的变化。
- 疾病机制研究：
- 研究特定疾病（如癌症、神经退行性疾病、感染性疾病等）相关蛋白质的变化。
- 鉴定疾病生物标志物。
- 药物作用研究：
- 评估药物处理对目标蛋白质的表达和修饰的影响。
- 研究药物作用机制和筛选潜在药物靶点。
- 蛋白质-蛋白质相互作用：
- 通过共免疫沉淀（Co-IP）结合Western Blot分析蛋白质间的相互作用。
- 研究蛋白质复合物的组成和功能。
- 诊断应用：
- 作为实验室诊断工具，检测疾病相关蛋白质。
- 监测疾病的进展和治疗效果。
Western Blot实验由于其高特异性和灵敏度，成为研究蛋白质功能、信号传导和疾病机制的重要技术手段。