最初的准备

细胞的准备

1. 包装细胞：293T细胞

2. 用于包装慢病毒的细胞最好只传代7-10代

3. 培养通常使用90%DMEM+10%FBS+GLutaMax(具体剂量不知)

Transfer Plasmid的大小

1. 在LTR之间可以插入的基因长度约8.5k,但超过3k就会影响效率

2. 非必要不要带其他元件

3. 需要考虑是否抛弃TAT

病毒稳定性评估

1. VSV-G包膜慢病毒对pH极为敏感

物品准备

质粒

1. Thansfer Plasmid（第二代或者第三代）

2. VSV-G：pMD2.G（addGene#12259)

3. Rev:pRSV-Rev(addGene#12253)

4. Gag/Pol:pMDLg/pRRE(addGene#12251)

5. Tat:pCEP4-tat(addGene#22502)——可要可不要

6. pSpAx2

细胞系

试剂

1. 293T培养基：高糖DMEM+10%FBS+GlutaMax

2. 病毒收获培养基：取50ml 293T培养基，加入0.5g BSA（Sigma A9418）和最终浓度为10mM的HEPES，0.22um过滤

3. Opti-MEM：用于混合转染复合物

4. 转染试剂：X-tremeGENE HP DNA（或其他低毒性高效率的试剂）

5. 无内毒素质粒提取试剂盒

6. Polybrene(10mg/ml)：用于感染实验

实验步骤

第一天

第二天-上午

第二天-下午

第三天：无事

第四天：

第五天：

病毒浓缩（可选）

1. 使用培养的细胞包装病毒完成后，收集含病毒上清液，4摄氏度，3500*G离心10min，以充分沉淀细胞碎片，小心吸取上清液用于后续浓缩

2. 也可以取含病毒上清液，使用0.45um枕头滤器（FF365/FF375）过滤以充分沉淀细胞碎片。

3. 去除4摄氏度预冷的病毒沉淀试剂（4X），1份病毒沉淀试剂：3份病毒上清液的比例混合，摇床上4度至少4h或过夜。（不宜超过24小时）

4. 小心吸除上清

病毒滴度检测及应用

流式检测

1. 将CHO或者293T接种于24孔板中，10^5/孔

2. 加入助转试剂（polybrane）

3. 加入病毒液：浓缩后病毒液稀释10倍加入1ul,2.5ul,5ul;原液5ul，10ul，25ul

4. 病毒加入48h后收集上述细胞，进行流式检验

5. 计算公式：病毒滴度（Tu/ml）=1e5 * 阳性率 / 体积 * 稀释倍率 * 1000

qPCR

1. 将CHO或者293T接种于24孔板中，10^5/孔

2. 加入助转试剂（polybrane）

3. 加入病毒液：浓缩后病毒液稀释10倍加入1ul,2.5ul,5ul;原液5ul，10ul，25ul

4. 病毒加入48h后收集上述细胞，提取基因组，绝对定量PCR检测GAG或WPRE拷贝数以及Alb拷贝数

5. 计算公式

1. 提取基因组前应用DNasel对细胞进行处理

2. 体积与拷贝数之间应该呈线性

注意事项

1. 流式检测慢病毒滴度通常浓缩液为：1e7~1e9 Tu/ml

2. 慢病毒感染病毒细胞时应当选择适当的MOI（感染复数），公式如下：

1. 对于CHO等容易感染的细胞MOI=1，不容易感染的细胞应选择其他MOI。