一、包埋与切片部分

1. 物品准备

实验材料与试剂

• 组织标本（如固定后的组织块）

• 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）固定液

• 乙醇：70%、80%、95%、100%梯度浓度

• 二甲苯

• 石蜡

• 包埋盒

• 滴瓶

• 切片刀片

• 载玻片

• 粘附性载玻片（如需要）

仪器与设备

• 包埋机

• 脱水机

• 微型切片机

• 漂片机

• 热台或烤箱

2. 具体步骤

1. 固定
将组织标本浸泡在10%中性缓冲福尔马林固定液中，固定12-24小时，确保标本完全固定。包埋前一天流水过夜

2. 脱水
固定后的组织按顺序放入75% 乙醇（1h） 、85%乙醇(1h)、95%乙醇(1h)、100%乙醇(1h)中。

3. 透明
将脱水后的组织浸泡于二甲苯2次中，通常每步30分钟，以清除组织中的乙醇。

4. 包埋
将透明后的组织浸泡在软蜡、硬蜡，通常浸泡各1小时。随后将组织置于包埋盒中，石蜡冷却后变为固态。

5. 切片
用微型切片机将石蜡包埋的组织切成4mm厚的切片。将切片漂浮于42℃的水中，并用载玻片拾取。

6. 烤片
将切片置于70℃的热台或烤箱中，烤片1小时，确保切片牢固附着于载玻片上。

3. 具体步骤

1. 写着70%乙醇 实际上是水 2h

2. 50%乙醇1h

3. 70%乙醇1h

4. 85%乙醇1h

5. 95%乙醇2h

6. 100%乙醇2h

7. 二甲苯 0.5h

8. 二甲苯 0.5h

9. 蜡 1h

10. 蜡 1h

二、免疫组化部分

1. 物品准备

实验材料与试剂

• 抗原修复液（柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液）

• 3% 过氧化氢溶液

• 一抗（目标抗体）

• 二抗（通常为HRP标记）

• DAB显色试剂

• 苏木精复染液

• 封片液

• PBS缓冲液

仪器与设备

• 恒温箱或烤箱

• 显微镜

2. 具体步骤

1. 脱蜡与复水
烘片过夜，将切片依次浸入环保型脱蜡液（15min×2次）、梯度乙醇（100% 10min、100% 10min,95% 5min、80% 5min、70% 5min），最后用蒸馏水(ddH₂O 10min)清洗复水。PBS浸泡7min+8min.

2. 抗原修复
使用微波加热修复法，柠檬酸缓冲液煮沸，加热10min，自然冷却至室温，冷却后用PBS清洗 5min 3次。

3. 过氧化氢封闭
组化笔画圈，使用3% H₂O₂溶液孵育10-15分钟，封闭内源性过氧化物酶，随后用PBS冲洗 5min 3次。

4. 封闭非特异性结合
放入湿盒，用封闭液（5%BSA———用PBS稀释）37摄氏度孵育切片1h。

5. 一抗孵育
将一抗（1）滴加在切片上，4℃过夜孵育（或根据抗体要求调整时间）。

6. 二抗孵育
放37摄氏度复温1小时，用PBS 5min*3次后，滴加二抗（1%BSA稀释），烘箱孵育90分钟（37摄氏度1h）。

7. DAB显色
用PBS 5min*3次后，滴加DAB显色液（50:1000），室温显色1-2分钟（自行摸索）。

8. 苏木素复染
苏木素染色3min（自行摸索），泡下水，分化液1-2秒（自行摸索），PBS返蓝，自行摸索时间，放室内晾干。

9. 封片
晾干后滴加封片液，盖上盖玻片，可在显微镜下观察。