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方法一 PEI法

物品准备

1. 状态良好的293T

2. Opti-MEM

3. PEI 40000(1ug/uL)

步骤

1. 细胞传代，转录前24h将细胞密度长至90%，且状态良好的293T消化，按1传3比例铺至新的培养皿中

2. 质粒计算：转录前按下表准备目的质粒、包装质粒、Opti-MEM、PEI 40000（1 ug/uL）,根据质粒用量和质粒浓度计算好各组所需质粒体积

1. 配置质粒，以10cm盘为例，每组准备一个无菌1.5mlEP管，依次加入1ml Opti-MEM、psPAX2、pMD2.G、目的质粒，轻轻吹匀成DNA稀释液。

2. 制备转染复合物：立刻向DNA稀释液中加入24ul PEI转染试剂，轻轻吹打混匀，室温下静置孵育15min，使得形成DNA-PEI阳离子核酸转染复合物。

3. 转染前换液：等待期间，将293T取出并放入超净台，移除旧培养基，每10cm盘加入10ml新鲜预热的10%FBS/DMEM完全培养基（轻柔）

4. 转染：静置孵育结束后，直接将转染复合物加入细胞培养基中（勿吹打），十字法轻摇培养盘，轻轻混匀。随后放入37摄氏度，5%CO2培养箱培养。

5. 转染后换液：转染后8-12h，移除培养基，每盘加入10ml 10%FBS/DMEM完全培养基（轻柔）。

6. 第一次收毒：转染后48h，将上清转移至一个50ml离心管中，置于4摄氏度。随后每盘加入10ml 10% FBS/DMEM 完全培养基（轻柔），并放入培养箱

7. 第二次收毒：转染后72h，将上清合并到50ml离心管中，1500ml离心去除沉淀，上清经0.45um无菌滤头过滤，分装至1.5mlEP管中，-80摄氏度保存。

方法二 lipo3000法

物品准备

1. 状态良好的293T

2. Opti-MEM

3. lipo3000

4. p3000

步骤

1. 293T长到70%转染

2. 目的基因：psPAX2:pMD2.G=4:3:1=1500ng：1125ng：375ng（总量3ug p3000 6ul；lipo3000 9ul）转染一个孔，配置15min后加入六孔板。（125ul opti-MEM+目的基因 1500ng+psPAX2 1125ng+pMD2.G 375ng+p3000 6ul ;125ul opti-MEM+lipo3000 9ul）。无抗性 10%DMEM

3. 8小时换液，换成有双抗 10% DMEM。

4. 48h收集上清 0.45um过滤，72h收集上清0.45um过滤，冻-80